《中國植物志》第四十九卷第三分冊記載，山茶科植物約有36屬、700種，我國有15屬、480余種。廣泛分布于熱帶與亞熱帶地區，是華南地區常綠闊葉林的建群種，其中不乏高價(jià)值的經(jīng)濟樹(shù)種。如原產(chǎn)我國的茶樹(shù)(Camelliasinensis)，其嫩葉可制茶葉;油茶(C.oleifera)富含油脂，可榨茶油，供食用和工業(yè)用;山茶(C.japonica)和茶梅(C.sasanqua)花大而艷麗，是世界著(zhù)名的木本花卉植物。山茶科還有許多珍稀瀕危植物，如金花茶(C.nitidissima)是我國～級保護植物，有“植物大熊貓”之稱(chēng)。山茶科中有很多植物為國家級珍稀植物，如豬血木(Euryodendronexcelsum)、圓籽荷(Apterospermaobla—ta)和杜鵑紅山茶(Camelliachangii)等，其中豬血木和圓籽荷為單種屬植物，已被列為國家二級保護植物。將植物組織培養技術(shù)應用于山茶科植物的快速繁殖，對保護山茶科樹(shù)種的種質(zhì)資源，豐富園林植物多樣性，緩解國內優(yōu)質(zhì)木材和園林綠化植物供應緊張的狀況，具有重要的意義。本文從山茶科植物組織培養外植體的選擇和分化途徑、基本培養基、激素及附加營(yíng)養成分的使用等方面探討組織培養技術(shù)在山茶科植物中的研究現狀和實(shí)際應用中存在的問(wèn)題。
1山茶科植物組織培養培養概況
山茶科野生植物大多生長(cháng)在深山老林，與世隔絕且生境范圍狹窄，性喜溫暖濕潤氣候，栽培環(huán)境應適當遮陰并保持一定的濕度，避免強陽(yáng)光長(cháng)時(shí)間直接照曬。由于它對栽培環(huán)境、土壤、水分及管理技術(shù)的要求比較高，加上資源稀少，應用受到極大限制，也導致人們對它的研究熱情不高。我國所有的山茶科15個(gè)屬中，只有山茶屬、大頭茶屬、木荷屬3個(gè)屬有組織培養成功的報道，這3個(gè)屬中僅有茶樹(shù)和油茶的組織培養技術(shù)已趨于成熟.更多的尚在起步階段。到目前為止，組織培養已獲成功的山茶科植物有茶樹(shù)(C.sinensis)、油茶(C.oleifera)”、滇大頭茶(Gordoniayunnanensis)、藪北茶(Yabu—kita)、木荷(Schimasuperba)和紅木荷(S.walli—chii)、金花茶(Camelliachrysantha)(表1)。
2山茶科植物組織培養外植體選擇和分化途徑
2.1山茶科植物組織培養外植體的的選擇外植體的選擇是植物組織培養能否成功的關(guān)鍵因素之一。外植體供體植株的年齡、發(fā)育階段、生長(cháng)環(huán)境和外植體取材部位不同可導致外植體生理狀態(tài)差異.從而影響組織培養的形態(tài)發(fā)生。山茶科植物組織培養采用的外植體種類(lèi)較多，包括莖尖、種子、花蕾等。無(wú)論何種外植體，它們所處的發(fā)育狀態(tài)與來(lái)源均影響體胚發(fā)生，如切取茶樹(shù)種子無(wú)苗萌發(fā)的子葉、胚芽、胚軸與胚根切段外植體，幾種外植體誘導胚性愈傷組織的能力存在差異，只有胚軸、子葉、胚芽能產(chǎn)生胚性愈傷組織，其中以子葉和胚軸形成的愈傷組織生長(cháng)較快。
2.2山茶科植物組織培養的分化途徑通常細胞組織培養獲得再生植株有兩條途徑，一是器官發(fā)生途徑;二是體細胞胚胎培養。從現有的報道來(lái)看，山茶科植物組織培養已獲成功的分化途徑有器官發(fā)生途徑和體細胞胚、花藥發(fā)生途徑兩種。
器官發(fā)生包括由莖尖、腋芽、原球莖、球莖、塊莖、鱗莖等外植體直接分化成器官的直接發(fā)生和外植體先脫分化形成愈傷組織再分化成器官的間接發(fā)生兩種。此途徑中莖芽和根是在愈傷組織或外植體的不同部位分別獨立形成的。在直接器官發(fā)生途徑中，以芽或帶芽莖段為外植體直接誘導芽的萌發(fā)獲得再生植株的植物有藪北茶、滇大頭茶、龍井茶、油茶。在間接器官發(fā)生途徑中，以莖段或葉為外植體通過(guò)誘導愈傷組織，再誘導芽的再生的植物有滇大頭茶、油茶。
體細胞胚胎培養是指雙倍體或單倍體的體細胞在特定條件下，未經(jīng)性細胞融合，而通過(guò)與合子胚胎發(fā)生類(lèi)似的途徑發(fā)育出新個(gè)體的形態(tài)發(fā)生過(guò)程¨。杜克久等將云南大葉茶(Camelliasinensisvar.as—samicaKitamura)胚性細胞系中懸浮培養物繼代轉入附加0.05mg/L2，4一D和0.5mg/LBA的改良MS液體培養基上暗培養28d后，誘導外植體產(chǎn)生黃色、松散顆粒的愈傷組織，再轉入到液體分化培養基上(不附加生長(cháng)調節劑，其余同誘導培養基)培養28d，獲得了不同發(fā)育時(shí)期的體胚。
花藥培養是把發(fā)育到一定階段的花藥接種在人工培養基上，使其發(fā)育分化成植株的過(guò)程。郭玉瓊等用鐵觀(guān)音的花蕾及花藥在含有0.5mg/L2，4一D的MS培養基上成功誘導出了愈傷組織。
3山茶科植物組織培養的基本培養基應用于山茶科植物組織培養的基本培養基主要有：MS、1/2MS、改良MS、ER、MT，以MS培養基居多。楊國偉等報道，MS比Heller、White培養基更利于茶樹(shù)愈傷組織的生長(cháng)，茶樹(shù)愈傷組織在MS培養基上誘導率可達到90%從已有的報道來(lái)看，基本培養基中的大量元素對山茶科植物組織堵養影響很大，MS培養基大量元素減半，不僅有利于山茶科植物莖段的誘導和生長(cháng)，而且有利于減少莖段的褐化，提高成活率。在實(shí)際應用中，大多數學(xué)者在誘導和增殖培養時(shí)采用全量的大量元素，而在生根培養時(shí)采用半量的大量元素。在組織培養時(shí)，由于培養物的光合作用能力較弱，所以需要在培養基中添加一些糖類(lèi)。一方面，糖作為碳源，為細胞的呼吸提供底物和能源;另一方面，在培養過(guò)程中，組織不斷從培養基中吸取糖，隨著(zhù)時(shí)間的延長(cháng)，糖濃度不斷降低，不能維持正常的滲透壓;此外，適宜的糖濃度對器官的發(fā)生也有重要作用。山茶科植物組織培養所需的蔗糖濃度多在4%，而金花茶胚培養需要6%～8%。
4山茶科植物組織培養的激素及附加營(yíng)養物植物生長(cháng)調節物質(zhì)是培養基中的關(guān)鍵物質(zhì)，雖用量極小，但在組織培養中起著(zhù)重要的調節作用。激素的種類(lèi)和不同功能激素的配比是影響外植體能否成功啟動(dòng)的關(guān)鍵因素之一。對茶樹(shù)而言，各因素對龍井茶愈傷組織誘導的作用大小依次為：2，4一D>6一BA>NAA。在山茶科植物愈傷組織或芽的誘導階段，大部分植物使用6一芐基腺嘌呤(6一BA)，濃度為0.5—4mg/Lj。畢方鋮等在油茶試驗中發(fā)現，在不同的6一BA濃度中，以30mg/L的誘導效果最好，芽的誘導率為73.33%，而在6一BA和NAA組合中，以6一BA3.0mg/L+NAA1.0mg/L為最佳濃度組合，誘導率最高，達83.33%。李建安等在廣寧紅花油茶和小果油茶的花藥培養試驗中發(fā)現，兩種油茶在MS+2，4一D0.6mg/L+NAA0.4mg/L和B5+2，4一D1.2mg/L+6～BA0.4mg/L培養基中，廣寧紅花油茶誘導率高達94.67%和91.00%，小果油茶則分別為8.00%和3.34%。椰乳、水解乳蛋白等營(yíng)養物質(zhì)也被用于山茶科植物的組織培養中。譚和平等通過(guò)茶樹(shù)腋芽的誘導分化試驗發(fā)現，水解乳蛋白的加入可明顯促進(jìn)芽的誘導。山茶科植物組織培養的生根培養只需單獨添加生長(cháng)素BA或NAA就能有效地生根。畢方鋮等在}由茶的生根培養試驗中發(fā)現，NAA7mg/L或BA6～7mg/L得到較好的生根效果，但獲得的再生苗大多只有一條主根，須根很少。
5山茶科植物組織培養及植株再生中存在的問(wèn)題
5.1山茶科植物組織培養中的褐變
山茶科植物中酚類(lèi)物質(zhì)含量較高，酚類(lèi)的糖苷化合物是木質(zhì)素、單寧和色素合成的前體。因此，當酚類(lèi)化合物含量高時(shí)，木質(zhì)素、單寧或色素形成就多，易導致褐變的發(fā)生，有些細胞會(huì )因褐變而死亡。較高的培養溫度、培養基中較高濃度的無(wú)機鹽、較高濃度的激素及木質(zhì)化程度高的外植體都會(huì )促進(jìn)褐變的發(fā)生。闕生全等在試驗中發(fā)現，以油茶莖段作為外植體誘導愈傷組織時(shí)，隨著(zhù)基本培養基中無(wú)機鹽離子濃度的降低，褐化現象減輕。在培養基中加入吸附劑能有效抑制褐化的發(fā)生。通過(guò)吸附劑活性炭、PVP和3種抗氧化劑(維生素C、NaSO，和檸檬酸)對褐化的影響對比發(fā)現，加入吸附劑(活性炭)的培養基效果最好，隨著(zhù)其濃度的升高，抗褐化效果提高。另外，接種后暗處理，可在一定程度上減輕褐化反應。
5.2山茶科植物組織培養中的污染問(wèn)題能否有效控制微生物污染是組織培養能否成功的關(guān)鍵因素之一。在山茶科植物組織培養中污染可分為外植體、培養基和無(wú)菌操作3個(gè)方面，其中以外植體方面的污染最復雜，也最難控制。通常在春季2～3月份和秋冬季腋芽在培養基上容易萌發(fā)，且污染現象不明顯;而在夏季腋芽不僅不容易萌發(fā)且容易污染。究其原因，一方面可能與外植體的季節性帶菌情況有關(guān);另一方面可能與外植體的生理狀態(tài)有關(guān)。此外，外植體消毒劑的選擇和消毒時(shí)間的選擇也影響污染情況。在油茶組織培養中，用25%次氯酸鈉消毒20min對油茶腋芽消毒效果最好，芽的萌發(fā)誘導率達85%。
6小結與展望
山茶科植物的組織培養研究中，除了油茶、茶樹(shù)等少數植物相對成熟外，還有許多種植物仍處于探索階段。大多數植物的誘導率、增殖率、生根率等都不高，離實(shí)際應用還有一定的差距;體細胞胚胎發(fā)生、細胞培養、原生質(zhì)培養的研究更有待于加強。山茶科植物組織培養研究的前景十分廣闊，很多山茶科植物都具有很高的經(jīng)濟價(jià)值和造園價(jià)值。因此。通過(guò)組培快繁技術(shù)實(shí)現山茶科植物的大規模生產(chǎn)，不但可以提高它們的應用價(jià)值，而且對物種資源保護和種群擴大有著(zhù)重大的意義。
